1. (2021·柳州模拟) 甘蓝型油菜中，抑制PEP基因的表达可提高油菜籽的含油量。通过基因工程将PEP基因反向连接在启动子后，构建转反义PEP基因油菜是提高油菜籽含油量的常用技术路径。请回答下列问题：

1. （1） 为将PEP基因反向连接在启动子后，构建反义PEP基因，需要将限制酶切位点设计在引物上，PEP基因的上游引物和下游引物中应分别引入酶切位点。
3. （2） 用激光照射油菜愈伤组织时，可在细胞膜上打出一个穿孔，转反义PEP基因表达载体由此小孔进入油菜细胞，几秒种后小孔封闭，该过程体现了细胞膜具有。目的基因表达载体进人细胞后，Ti质粒上的区段可转移到油菜细胞的基因组中。
5. （3） 筛选时，需在油菜愈伤组织培养基中加入进行初步选择。 在激光照射下，存活的细胞一般会发出。为检测反义PEP基因是否整合到染色体上，研究者通常用检测细胞中是否存在ntp基因，而不检测PEP基因。不直接检测PEP基因的原因是。
7. （4） 已知PEP基因的转录模板链为A链，则反义PEP基因的转录模板为．转反义PEP基因油菜中PEP基因的表达受阻，原因是。