1. (2021·淮安模拟) 肌肉生长抑制素（MSTN）是肌肉发育的一种负向调控因子，MSTN 突变体动物的肌肉更加发达，瘦肉率更高。科研人员采用 ZFN 基因编辑技术在梅山猪的 MSTN 基因中引入突变，培育高瘦肉率的梅山猪新品种。

1. （1） ZFN 基因编辑系统的作用原理如图所示，ZFN-L 和 ZFN-R 蛋白结合 DNA 上的特定序列（图中带有下划线的序列），之后由连接在 ZFN 上的 FokI 蛋白将 DNA双链切开（FokI 仅当其与 ZFN 形成二聚体时才可以切割 DNA），在细胞修复 DNA损伤时可能会引入突变，关于此过程下列说法正确的有（填序号）。

   ①FokI 作用于 DNA 上的磷酸二酯键，切开双链会产生 4 个游离磷酸基团

   ②若没有 ZFN，FokI 可能会失去切割能力

   ③设计 ZFN-L 和 ZFN-R 的识别序列时，两个识别序列的 CG 碱基占比应当基本保持一致

   ④设计 ZFN 系统时，采用 ZFN-L 和 ZFN-R 分别连接 FokI 单体，而非 ZFN 直接连接 FokI 二聚体，可以减少对 DNA 的非特异性切割

   

3. （2） 相比于传统的用限制酶切开 DNA 的方法，ZFN 基因编辑系统的优势在于。
5. （3） 研究团队合成了带有 ZFN 系统合成基因的质粒，将质粒转入猪胚胎成纤维细胞中。为了筛选基因编辑成功的细胞，科研人员采用有限稀释法，将细胞群稀释为，培养得到单克隆细胞群，利用方法）检测其基因是否被成功编辑。
7. （4） 成功基因编辑的细胞，经检测其 MSTN 基因编码链（非模板链）中的一个 T 突变为了 G，科研人员提取细胞中的 RNA，通过取得 cDNA 进行测序，发现突变后 MSTN 基因的 mRNA 缩短了 193 个碱基，导致无法翻译出正常的 MSTN 蛋白质。已知真核生物转录后进行 RNA 中的内含子切除时，通过“GU-AG”原则识别内含子，即内含子的起始必须是 GU 碱基，末端必须是 AG 碱基，结合此材料分析突变后 MSTN 基因 mRNA 大幅度缩短的原因可能是。
9. （5） 基因编辑成功的猪均为 MSTN 突变杂合子。将这些猪相互交配得到 F₁ ， 提取猪肌肉细胞中的蛋白质，用 Western blot 法检测，Western blot 法先将蛋白质进行电泳分离，再以抗体结合目标蛋白质，成功结合可以观察到相应条带，抗体结合步骤中 MSTN 作为。抽样检测得到了三种电泳结果，其中出现电泳结果③的猪在 F₁中占比大约是。（图中的 GADpH 是甘油醛-3-磷酸脱氢酶，细胞呼吸中的一种酶）