1. (2021高二下·常州期末) 肠道病毒EV7₁是RNA病毒，其表面蛋白为VP₁～VP₄ ， 分别由V₁～V₄基因控制。为研究VP₁～VP₄的抗原性，从中筛选出EV7₁的疫苗抗原，研究人员利用基因工程技术生产了上述4种蛋白质。如图是制备V₁基因表达载体的过程示意图，请回答下列问题：

1. （1） 以RNA为模板，通过4组RT-PCR可分别获取V₁～V₄基因（DNA）。RT-PCR 所需要的酶有，

   该过程中子链延伸时所需的能量较为特殊，一般来自。

3. （2） 为方便目的基因与质粒的连接，通常将限制酶的切点设计在引物上。引物一般为单链DNA，新合成子链的延伸方向为5^’→3^’。PCR 获取V₁基因时，引物中限制酶切点的碱基序列应设计为上游引物 3^’……5^’ ， 下游引物 3^’……5^’。
5. （3） 用相关限制酶处理质粒和V1基因后，再与酶混合，加入大肠杆菌温育。一段时间后，将菌液涂布在含有和的平板上，经培养，在平板上长出白色和蓝色两种菌落，其中菌落含有V1基因表达载体，判断依据是。
7. （4） 通过基因工程制备了VP₁～VP₄抗原后，需对4种抗原进行检测。检测1：将4种抗原分别注射小鼠，检测小鼠能否产生相应抗体。检测2：这些抗体能否中和EV71病毒（和病毒形成沉淀），结果如下表。

   抗原	检测项目
   	检测1	检测2
   VP1	﹢	﹢
   VP2	﹣
   VP3	﹣
   VP4	﹢	﹣
   “﹢”表示能，“﹣”表示不能

   检测结果表明，可用作 EV71的疫苗抗原。其他3种不能作为 EV71疫苗抗原的理由是。