1. (2022·广东模拟) 生活在寒温带的“美洲叔蝶”冷水鱼，能产生大量的抗冻蛋白。科研人员利用其抗冻基因 AFP ， 培育出抗冻番茄植株。其研发技术路线如下图（其中“ampr”为氨苄青霉素抗性基因，“→”所示为对应限制酶的切割位点）。

1. （1） 利用 PCR 技术获取目的基因时，需要设计引物，设计引物的前提是，至少需经过次循环才能分离得到所需的目的基因区段。
3. （2） 为提高重组质粒的成功率，切割质粒和目的基因的限制酶应选择。
5. （3） 获得含抗冻基因的重组质粒后，进行如下实验切割原质粒和重组质粒，获得片段大小如下表 （注意： DNA 片段大小与图中所画比例一致）

   限制酶	Alu I	Sma I 和 Pst I
   原质粒	7.9kb	1.3kb、 6.6kb
   重组质粒	3.1kb、 5.7kb

   分析数据，计算可得鱼抗冻基因的长度为kb。

7. （4） 为了检测获得的转基因番茄苗中是否成功导入目的基因，可以采用 PCR 技术，对转基因番茄苗的基因组进行扩增，引物组合可以选择。

   

9. （5） 若获得的转基因番茄植株抗冻能力没有提高，可能的原因是。