1. (2022高二下·云浮期末) （研究证实，人低氧诱导因子（HIF-1a）表达水平与肝癌的发生发展具有密切关系，HIF-1a在肝癌细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞的。CRISPR/Cas9基因编辑技术是通过人工设计的sgRNA（向导RNA）来识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割目的DNA双链，形成双链断裂，而在细胞自我修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象等，最终干扰基因组DNA的表达。使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除HIF-1a基因可以为肝癌治疗提供新途径。回答下列问题：

1. （1） 由题意可知，Cas9蛋白酶很可能作用于DNA的部位造成了双链断裂，其作用效果类似于基因工程中的酶。CRISPR/Cas9基因编辑技术往往会导致细胞中发生（填变异类型），从而干扰了目的基因的表达。
3. （2） 科研人员构建了靶向HIF-1a基因的CRISPR/Cas9重组质粒，并用重组质粒通过法对肝癌细胞进行转染，利用其敲除肝癌细胞中的HIF-1a基因。可通过来检测CRISPR/Cas9基因是否在目的细胞中发挥作用。
5. （3） 通过12孔板筛选获得基因敲除的混合克隆细胞株，然后用HIF-1a表达诱导剂（CoCl₂）诱导相关细胞，提取蛋白，用Westernblot法（分离检测蛋白质的一种方法）检测HIF-1a蛋白的表达，以相应条带宽度值（越大）表示表达水平（越高）。下图为三种肝细胞HIF-1a蛋白的检测结果：

   

   分析上图可知，1、3、2中HIF-1a蛋白表达水平逐渐增高，说明；，表明HIF-1a基因敲除成功。