1. (2023高三下·辽宁月考) 研究者将酿酒酵母S288c的APAl基因与EGFP（增强型绿色荧光蛋白）基因构成融合基因，并进一步构建表达载体（如图甲所示）。以该载体为模板，再通过PCR介导的定点突变技术向APAl基因中分别引入突变位点，经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR技术的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图乙所示，其中引物箭头代表子链延伸方向。回答下列问题：

1. （1） 构建表达载体时，应将融合基因放于、等结构之间，以保证目的基因的转录。为实现质粒和融合基因的高效连接，切割质粒时选用限制酶XmaI而不选用限制酶Sma I的原因是。为将融合基因构建在质粒上，还需要等酶。
3. （2） 利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR（PCR1和PCR2）。在PCR1中，至少需要个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中？处的引物应选用大引物两条链中的（填“①”或“②”）链。
5. （3） 若在荧光显微镜下观察到受体细胞有绿色荧光，则表明，EGFP基因的作用是。