1. (2023·台州模拟) 产黄青霉是青霉素工业生产的常用菌，利用诱变育种和基因工程育种方法获得高产菌并进行发酵生产。回答下列问题：

（一）菌种的选育及保存。

（二）发酵过程及产物分离纯化。发酵流程为：活化培养→一级种子罐→二级种子罐→发酵罐（发酵）→放罐。

1. （1） 诱变育种。在山梨醇溶液中用酶水解产黄青霉细胞壁，得到原生质体，推测山梨醇溶液的作用是用15W的紫外线在距离培养瓶20cm处照射产黄青霉原生质体，诱发其发生变异。为检测是否发生变异，可利用显微镜观察其细胞核中染色体变化，也可以接种到固体培养基上，经培养后观察变化。
3. （2） 基因工程育种。

   ①将产黄青霉涂布于三种抗生素的一系列不同浓度的平板上，在26℃培养箱中培养12小时，研究菌落生长情况。结果发现，四环素浓度达250ul/mL，菌落数开始减少，氯霉素浓度高达500ul/mL，菌落仍然能正常生长，10u1mL腐草霉素足以抑制菌落生长。据此推测，应该选用基因作为筛选标记基因。

   ②获得促进产黄青霉大量合成青霉素的目的基因，经PCR扩增后，连接到真菌表达载体上，真菌表达载体上除了有标记基因、复制起点还有，使目的基因得以表达。

   ③利用PEG介导的原生质体转化法将表达载体导入产黄青霉原生质体。影响转化效率的因素除表达载体的大小和数量、PEG浓度及外界因素外，还有等（写出2点）。

5. （3） 菌种保存。以上两种方法筛选得到的高产菌，一般通过制备繁殖体孢子，利用真空干燥，低温长期保存。采用孢子保存而不直接保存菌丝的原因是。
7. （4） 发酵条件的控制：产黄青霉菌丝生长温度为27℃左右，分泌青霉素温度为20℃左右。所以种子罐的温度一般要比发酵罐的。产黄青霉培养基的pH应控制为，增加培养基中溶氧量的方法有控制通入无菌空气的速度和控制速度。发酵过程会产生泡沫，需要用消沫剂除去泡沫，以提高发酵效率。下列哪些因素会使发酵液产生的泡沫增多？（A.发酵菌细胞呼吸产气增多B.加速搅拌发酵液C.通气增多D.培养基黏度高）
9. （5） 产物的分离纯化：发酵过程结束后，可通过得到发酵液，加少量絮凝剂沉淀蛋白后，根据青霉素易溶于有机溶剂的特性，可采用的方法进一步分离纯化。