1. (2023高二下·常熟期中) 下图是将乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程示意图。巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达，图中pPIC9K质粒上5'AOX1和3'AOX1（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子。该酵母菌体内无天然质粒，科学家改造出了图1所示质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。请分析并回答下列问题。

1. （1） 为实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，设计引物时需要在引物的端添加相应①限制酶的识别序列，则在HBsAg基因两侧的A和B位置添加的碱基序列分别是、，这样设计与只添加同一种碱基序列相比的优点是。

   

3. （2） 酶切获取HBsAg基因后，需用（填“E．coliDNA连接酶”或“T₄DNA连接酶”）．将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，构建重组质粒的目的是。
5. （3） 若用限制酶SnaBI、BglⅡ联合酶切pPIC9K质粒，获得的DNA片段按顺时针方向，依次分别是42kb、26kb、68kb；用限制酶BglⅡ、AvrⅡ联合酶切pPIC9K质粒，得到的DNA片段按顺时针方向，依次是42kb、40kb、54kb；已知HBsAg基因长度是60kb。步骤3中应选用限制酶来切割重组质粒以获得重组DNA，切割后的重组DNA的长度是。
7. （4） 转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇，其目的是。