1. (2023高二下·浙江月考) 研究表明来源于大肠杆菌的苏氨酸输出蛋白（由rhtA基因编码）能够识别5-氨基乙酰丙酸，并将其输出至细胞外。为探究苏氨酸输出蛋白的作用，研究人员从大肠杆菌的基因组DNA中扩增出rhtA基因，并构建出相应的重组质粒，获得转rhtA基因的工程菌，其基本操作流程如图所示，已知引物A、B的序列分别是：

5′AGGAAACAGACCATGGAATTCATGCCTGGTTCATTACGTAAAATG3′、

5′GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTAATTAATGTCTAATTCTTTTATTTTGCTC3′。

  回答下列问题：

1. （1） 由图可知，获取大量rhtA基因要经PCR技术扩增，若要扩增出N个rhtA基因，需要引物A、B各个，对引物A的设计要求是、（答出2点即可）；通过过程①得到重组质粒，需选用的两种限制酶是，两者起作用部位的化学键是。
3. （2） 过程②⑤在操作时，一般需用钙离子处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种的生理状态。过程③将大肠杆菌体内的质粒提取出来进行验证时，以EcoRI切割pEC-XK99E质粒为对照，分别对重组质粒用EcoRI单酶切、以（1）选用的双酶对重组质粒进行双酶切，然后用技术进行验证，其实验结果如图所示，若2是对照，则3、4分别是单酶切、双酶切的结果，做出此推测的依据是用EcoRI单酶切对照和重组质粒，均使质粒成为，2的DNA条带略比3小，是因为，4被双酶切后形成。

    

5. （3） 将正确的质粒导入AL9后，后续的步骤是。本技术选用微生物大肠杆菌作为受体细胞，而不选用动物细胞，理由是（答出一点即可）。