1. (2023高二下·阜阳期末) 大多数奶酪的生产需要使用凝乳酶来凝聚固化奶中的蛋白质，科学家将编码牛凝乳酶的基因(长度1.5kb)导入大肠杆菌获得工程菌，再通过工业发酵批量生产凝乳酶，下图为所用载体示意图，下表为限制酶的识别序列及切割位点。请根据图表回答问题：

限制酶	Hind Ⅲ	Pvit2	Kpn I	EcoR I	Pst I	BamH I
识别序列	A↓AGCTT	CAG↓ CTG	G↓GTACC	G↓AATTC	CTGC↓AG	G↓GATCC

1. （1） 获取牛凝乳酶基因：利用PCR可以获取和扩增牛凝乳酶基因，PCR每次循环一般可以分为、和三步。
3. （2） 构建基因表达载体：为使目的基因与载体正确连接，在扩增目的基因时，应在其一对引物的5’端分别引入两种不同限制酶的识别序列。在目的基因和载体连接时，可选用(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
5. （3） 将目的基因导入受体细胞：先用处理大肠杆菌细胞，使其处于的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
7. （4） 筛选与鉴定：将转化后的大肠杆菌接种在含的培养基上进行培养，随机挑取菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒，用题(2)中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如下图，号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。