1. (2024高二下·广东月考)  在未断奶的小牛胃中存在一种凝乳酶，被广泛应用于奶酪和酸奶的生产。科学家将编码牛凝乳酶的基因（长度1.5kb）导入大肠杆菌获得工程菌，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。

1. （1） 提取小牛胃黏膜组织中的mRNA，经逆转录得到cDNA，选择合适的引物进行PCR扩增，PCR引物碱基数一般在20～30个之间，过短则导致。
3. （2） 如表为操作过程中可能用到的限制酶，图1为获得的目的基因及末端（除黏性末端序列外，其他碱基序列省略），图2为要使用的质粒，其中的Tet^r、Amp^r分别为四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。对质粒进行切割时，选用的两种限制酶为。目的基因和质粒能连接成重组质粒的原因是，导入的目的基因在受体细胞中能成功表达的理论基础是。

   限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	SmaⅠ	Sau3AⅠ
   识别位点及切割位点	—G↓GATCC—	—T↓GATCA—	—CCC↓GGG—	—↓GATC—

   

5. （3） 将转化后的大肠杆菌接种在含的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如下图，号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。

   

   注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中

7. （4） 已知凝乳酶第20、24位氨基酸变成半胱氨酸，其活性可显著提高。科研人员希望运用蛋白质工程技术获得活性更强的凝乳酶，请选用合适的措施编号并排序：。（用箭头表示）

   ①重组DNA分子导入大肠杆菌

   ②随机改变凝乳酶基因的序列

   ③分析突变蛋白功能，设计结构

   ④改变凝乳酶基因的特定序列

   ⑤培养细胞后提纯突变蛋白

   ⑥将改变后的凝乳酶基因与质粒重组