1. (2023高三上·海安期末) 红景天中的HMA3基因能编码Cd转运蛋白，科研人员将红景天中的HMA3基因转入栾树，以实现栾树的定向改良，使其增强对Cd的富集能力，从而更有效治理Cd污染。实验的主要流程如下，其中Hyg^r为潮霉素抗性基因，Kan^r为卡拉霉素抗性基因，请回答：

1. （1） 重组质粒的构建、扩增、保存

   ①从红景天细胞中提取总RNA为模板，进行RTPCR。其中PCR的反应条件：98℃10s，55℃30s，72℃1min，35个循环，其中55℃30s过程称为。若模板双链cDNA的数量为a个，经过35个循环需要消耗引物的数量是。

   ②为构建Cd转运蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白，需确保目的基因与质粒正确连接。构建重组质粒时用酶切PCR纯化产物（已添加相应酶切位点）及Ti质粒，然后通过DNA连接酶进行连接制备重组质粒，并依次转入大肠杆菌和农杆菌。

3. （2） 栾树愈伤组织的诱导

   切割无菌苗将其茎段插入愈伤组织培养基，培养基应添加（填植物激素的名称），放入培养箱，经过21d的黑暗诱导，茎段经形成愈伤组织。

5. （3） 农杆菌介导转化体系的建立

   将农杆菌单克隆菌株对栾树愈伤组织进行侵染转化，并用添加的培养基筛选出转化成功的愈伤组织，将愈伤组织继续培养成完整植株。待幼苗长出较为发达的根系后进行移栽炼苗，炼苗的目的是。

7. （4） 原生质体制备及目的基因的检测和鉴定

   ①取4g筛选后愈伤组织，用镊子轻轻捣碎，冲洗。用滤网过滤溶液，将愈伤组织转移至含的酶解液中处理一段时间获得原生质体。

   ②在激光共聚焦下观测到细胞膜发出绿色荧光。在本研究中选择GFP与Cd转运蛋白构建融合蛋白的目的是。若要从个体生物学水平上进行目的基因的检测与鉴定，则可以检测比较转基因栾树与野生型栾树。